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自动分析法
〔适用于核黄素含量大于等于0.1μg/g的样品〕。
A 装置
A.a 自动分析仪
Technicon Ⅱ型自动分析仪系统，其流程图如图24-1所示。
A.b 荧光计
配有LY-013-B008-01-C流通池的Technicon荧光分光光度计。
A.c 滤光片。
A.d 玻璃电极
小直径型，适于在容量瓶内调节溶液的pH。
A.e 过滤介质
不吸附核黄素的玻璃纤维纸。
B 试剂
B.a 润湿剂
30%Brij-35水溶液。
B.b 偏磷酸溶液
溶解15gHPO3于1L水中，用NaOAc溶液调节pH至1.9，加30g NaCl和1ml润湿剂，过滤。
B.c 醋酸钠溶液
1.25M。溶解345g NaOAc·3H2O于水中，稀释至2L。
B.d 偏磷酸缓冲液
pH4.3。溶解15g HPO3于1L水中，并用NaOAc晶体调节pH至4.3。当天新鲜配制。
B.e 洗涤液
用1.25M NaOAc〔约240ml〕将2L 0.1M HCl溶液的pH调至4.3。然后加入pH4.3的HPO3缓冲液(d)，使体积为4L。再加入4ml润湿剂。
B.f 渗析接受液
将洗涤液和HPO3溶液(b)等体积混合。
B.g 醋酸钠溶液
0.4%。溶解4.0g NaOAc·3H2O于水中，稀释至1L。
B.h 高锰酸钾溶液
1%。溶解2.0g KMnO4于200ml水中〔用电磁搅拌30min〕，经玻璃纤维GF/A过滤器过滤，于深色玻瓶内保存。
B.i 亚硫酸氢钠溶液
溶解1.1g NaHSO3于50ml pH7的磷酸盐缓冲液〔每升中4.55g KH2PO4和9.45g Na2HPO4〕中，使用时，通过目视调节连续流动系统中的NaHSO3浓度，使用比需要还原KMnO4的量过量约10%。避免NaHSO3过量太多。一旦NaHSO3用量确定后，除更换泵管外，不需要重新调节。
B.j 连二亚硫酸钠溶液
溶解2g Na2S2O4于100ml 0.4%NaOAc溶液中，用时将其置于冰浴中〔稳定约2h〕。
B.k 核黄素标准液
B.k.1 贮备液
50μg/ml。溶解50.0mg核黄素〔保存于暗处的干燥器中〕于约800ml 0.1M HCl中〔需电磁搅拌过夜〕。再用0.1M HCl稀释至1L。液面滴加甲苯于暗处保存。每两周新鲜配制一次。
B.k.2 中间溶液
10μg/ml。用0.1M HCl稀释40ml贮备液至200ml。
B.k.3 工作液
1μg/ml。用0.1M HCl稀释10ml中间溶液至100ml。溶液〔2〕和〔3〕于使用当天配制。随同样液分别吸取1，3，5，10和15ml工作标准液于100ml琥珀色容量瓶中，相应加入49，47，45，40和35ml 0.1M HCl，制备0.01,0.03,0.05,0.1和0.15μg/ml核黄素标准系列。样品溶液与标准溶液以相同的方式在高压釜内处理。
C 样品制备
将一份有代表性的样品磨细过40号筛。
D 测定
准确称取一份〔最多1.5g〕磨细的样品〔约含核黄素10μg〕于100ml琥珀色容量瓶中，加入50.0ml 0.1M HCl，加HCl时要向下冲洗烧瓶壁，并使样品分散。以铝箔覆盖瓶口，置于高压釜内于121℃热压30min，缓慢地释放釜内压力，以防止崩沸。冷至室温〔溶液可于该温度下保存〕。对于水解过程中易喷溅的样品，可改用锥形烧瓶，经高压釜处理后转移至容量瓶中。$$在旋转摇动下加入预定量的1.25M NaOAc[用定量加液装置很方便，调节装置使所取那份1.25M NaOAc加到50.0ml 0.1M HCl中，pH恰为4.3±0.1〔约6.0ml〕]。加入约35ml pH4.3的HPO3缓冲液，用pH计检查pH值，调节水解样液的pH，使其与标准相差大于等于0.1pH单位。[如也用该液测定硫胺素，则加5.0ml高淀粉酶溶液〔5%pH4.3的HOAc〕，于37℃培养过夜再稀释定容。酶水解并不影响测定核黄素，但标准液也须加酶溶液，因为酶溶液中含有少量核黄素。]用pH4.3 HPO3缓冲液稀释至刻度。滴加一滴润湿剂，用玻璃纤维滤纸过滤。$$泵送高浓度(0.15μg/ml)标准液通过系统，调节荧光计上的标准校正旋扭使记录笔达满量程。泵吸和泵送标准系列与样品滤液通过系统，每连续测20个样品，用0.1μg/ml标准液检查漂移。若样品液浓度高于最高标准液浓度，则可用洗涤液稀释样液，使其峰高落在标准范围内。测定完全部样品，用Na2S2O4替换NaOAc，使至基线稳定为止，并调回原基线位置，重新进样品滤液，测定相应的空白值。$$标准系列得到的标准曲线是过原点的线性标准曲线，样品峰高减去空白峰高，则可从标准曲线上确定样品浓度C，μg/ml$$核黄素mg/100g＝C×10/W$$式中W为样品克数。 |
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